免疫球蛋白提取实验注意事项及原因

免疫球蛋白提取实验注意事项及原因
免疫球蛋白提取实验注意事项及原因

免疫球蛋白提取实验注意事项及原因
IgG的分离与提纯
（一）材料与试剂配制
1．动物血清
2．硫酸铵饱和溶液
硫酸铵 800g~850g
H2O 1 000ml
加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）.
注：硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响.如次品必须除去重金属,可在溶液中通入H2S,静置过夜后滤过,加热蒸发H2S即可.
3．0.01Mol/L pH7.4PB液
A液：0.10Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4•2H2O 15.60g
加H2O至 1 000.ml
B液：0.10Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4•12H2O 35.80g
加H2O至 1 000ml
取A液19ml,B液81ml加水至1 000ml即可.
4．1％BaCl2溶液
5．纳氏液
HgI 115.00g
KI 80.00g
加H2O至 500.00ml
溶化后过滤,然后再加20％NaOH500.00ml,混合即可.
6．0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液.
7．洗脱液：0.03Mol/L的NaCl液.
8．透析袋（或玻璃纸）.
（二）操作方法
1．取20ml血清,加生理盐水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成20％(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min.
2．3 000r/min离心20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白.
3．在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液30ml,使成50％（NH4）2SO4溶液,充分混合,静置30min.
4．3 000r/min离心20min,弃上清.
5．于沉淀中加20ml生理盐水,使之溶解,再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成33％(NH4)2SO4溶液,充分混合后,静置30min.
6． 3 000r/min离心20min,弃上清,以除去白蛋白.重复步骤5,2~3次.
7． 用10ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋.
8． 透析除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于4℃透析24h,中间换液数次.
以1％BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4+（取3~4ml透析液,加试剂1~2滴,出现砖红色即认为有NH4+存在）,直至无 SO42-或NH4+出现为止.也可采用SephadexG25或电透析除盐.
9． 离心去沉淀（去除杂蛋白）,上清液即为粗提IgG （即γ球蛋白,如以36％的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白).
10．过DEAE－纤维素层析柱.（装柱过程见层析技术）.以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脱,收集洗脱液.
也可采用SephadexG150或G200柱.
11．蛋白质及其定量鉴定（见本章第八节）.
12．IgG的纯度鉴定 可采用下列方法之一鉴定.
⑴ 区带电泳：玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可.加样电泳后,只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带.操作时,同时可用全血清样品,不同浓度（NH4）2SO4盐析样品进行电泳,以资比较.
⑵ 琼脂双相双扩散鉴定：预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清.将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散,如IgG提纯的话,则在两样品孔之间出现一条沉淀线.
⑶ 免疫电泳鉴定：（操作见第三章免疫电泳部分）.孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观察结果.如果提取的IgG纯的话,则只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于γ—球蛋白区.此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较.
⑷ 圆盘电泳鉴定：用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳.全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带,而纯化的IgG则只有一条区带.
13．IgG的浓缩与保存
⑴ IgG的浓缩：参看本章第九节.
⑵ IgG的保存：一般浓缩至1％以上的浓度,再分装成小瓶冻干保存,或加0.01％硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存,注意防止反复冻融.
（三）IgG的简易快速提取法
应用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素层析法提纯化的IgG,不仅操作复杂、需时较长,处理过程中样品体积大大增加,而且透析时变性严重,容易引起抗体效价降低等.为了克服这一不足,特别是当大量提取IgG时,则往往采取下列的简易办法.
1． DEAE-纤维素直接提取法
取样品直接过DEAE-纤维素柱.下面介绍的是最为简单的烧杯法.
⑴ 以一定数量的DEAE52放入烧杯中,加入0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液,静置30min,去上清细粒,再重复一次.
⑵用布氏漏斗（内放两层滤纸）过滤.
⑶以5g湿重的DEAE-纤维素加1ml血清及3ml蒸馏水混合液的比例,加入各成分,充分搅拌.
⑷于4℃中放置1h,中间搅拌数次.
⑸用布氏漏斗抽滤,再用0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液冲洗纤维素,抽滤.滤液即为提取的IgG液.
2．DEAE－SephadexA－50为弱碱性阴离子交换剂,经NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白,血清中除γ－G属中性蛋白外其余均属酸性蛋白.当溶液的pH在6.5时,酸性蛋白均被DEAE－SephadexA－50吸附,只有γ－G留在溶液中.因此利用这一原理可以提取γ－G.这种提取法流程大大缩短,纯化前后样品体积变化不大,而且所得γ－G无变性现象.经过四次处理,其纯度也较好.缺点是收集量少,损耗大.
⑴ DEAE—SephadexA—50的处理.取DEAE－SephadexA－50若干克,悬浮于蒸馏水中,1h后倾去上层小颗粒,然后用0.50Mol/L NaOH处理1h,蒸馏水洗至中性,再用0.5 Mol/L HCl处理0.5h,水洗至中性,最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干.
⑵ 取一定的血清量,加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液,再加液体体积1/4的滤干的DEAE－SephadexA－50,混合、4℃放置1h,不时搅拌、抽滤、收集滤液.
⑶ 再用同样重量的DEAE－SephadexA－50处理滤液.反复处理三次.（全程共四次）.获得滤液即为γ－G制品.
⑷ DEAE－SephadexA－50的回收.用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脱,抽滤至滤液中无蛋白（OD280﹤0.04）后,再用蒸馏水洗至中性即可回收使用.